Alte DNA bezüglich

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13635 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Paläogenomik trägt dazu bei, unser Verständnis vieler wichtiger evolutionärer Ereignisse mit beispielloser Auflösung zu verfeinern, mit relevanten Auswirkungen auf mehrere Bereiche, einschließlich der Phylogenetik ausgestorbener Arten. Bisher wurden nur wenige noch existierende und ausgestorbene Tierarten aus Mittelmeerregionen auf DNA-Ebene charakterisiert. Der sardische Pika, Prolagus sardus (Wagner, 1829), war eine ikonische Hasentierart, die Sardinien und Korsika bevölkerte und im Holozän ausstarb. Es gibt eine gewisse wissenschaftliche Debatte über die phylogenetische Zuordnung der ausgestorbenen Gattung Prolagus zur Familie Ochotonidae (eine der beiden einzigen noch existierenden Familien der Ordnung Lagomorpha) oder zu einer separaten Familie Prolagidae oder zur Unterfamilie Prolaginae innerhalb der Familie Ochotonidae. In dieser Studie haben wir erfolgreich einen Teil des Mitogenoms eines sardischen Pika aus der Jungsteinzeit rekonstruiert, der aus der Cabaddaris-Höhle, einer archäologischen Stätte auf Sardinien, geborgen wurde. Unsere kalibrierte Phylogenie könnte die Hypothese stützen, dass die Gattung Prolagus eine unabhängige Schwestergruppe der Familie Ochotonidae ist, die vor etwa 30 Millionen Jahren von der Abstammungslinie der Gattung Ochotona abwich. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, die phylogenetische Interpretation der morphologischen Besonderheiten der Gattung Prolagus zu verfeinern, die bereits in paläontologischen Studien beschrieben wurden.

Studien an alter DNA (aDNA) ausgestorbener Tierarten haben es ermöglicht, in die Vergangenheit einzutauchen und klassische paläontologische Ansätze zu ergänzen, um Evolutionsverläufe auf einem beispiellosen Niveau zu rekonstruieren1,2,3,4,5,6. Insbesondere mitochondriale DNA (mtDNA) stellt aufgrund ihrer Häufigkeit in antiken Überresten in Bezug auf das Kerngenom, ihrer hohen Mutationsrate und ihres nahezu neutralen Evolutionsmodus ein nützliches Werkzeug zum Verständnis der Phylogenie und Populationsdynamik dar7,8,9,10,11, 12.

Bisher wurden einige ausgestorbene Tierarten aus Mittelmeerregionen auf DNA-Ebene charakterisiert, was Aufschluss über die einzigartige Evolutionsgeschichte isolierter und endemischer Arten gibt3,4,7,13,14,15,16. Eine interessante Fallstudie basiert auf einer ausgestorbenen sardischen Art. Paläogenomische Daten zum rätselhaften ausgestorbenen sardischen Dhole, Cynotherium sardous Studiati, aus dem Jahr 1857 zeigten, dass diese einzigartige Canidenart, die die Insel bis zum Ende des späten Pleistozäns bevölkerte, ein von allen anderen lebenden Caniden getrenntes Taxon darstellte und genetisch von anderen isoliert wurde Canid-Abstammungslinien auf dem Festland etwa 500–300 kya (mittleres Pleistozän)4.

Eine weitere rätselhafte und ikonische ausgestorbene Art, die Sardinien und Korsika bevölkerte, ist der sardische Hecht Prolagus sardus (Wagner, 1829)17,18,19. Die Gattung Prolagus Pomel, 1853, die zur Ordnung Lagomorpha gehört, ist durch mehrere Arten dokumentiert, die während des Neogens und des Quartärs lebten19,20,21. Fossilien dieser Gattung wurden an vielen Orten in Europa, Nordafrika und Anatolien identifiziert. Die Evolutionsgeschichte und die Anatomie von Prolagus wurden von mehreren Autoren diskutiert, die diese Gattung traditionell als ein besonderes Mitglied der Familie Ochotonidae betrachteten. Thomas, 189720,21,22,23,24,25,26,27,28,29, dass umfasst derzeit nur die lebenden Pikas, die alle der Gattung Ochotona zugeordnet sind. Link, 1795. Einige andere Autoren haben jedoch vorgeschlagen, dass alle ausgestorbenen Prolagus-Arten zur separaten Familie Prolagidae Gureev, 1964, oder alternativ zu einer Unterfamilie der Ochotonidae, Prolaginae, gehören23 ,24,25,26,27,28. Das Fehlen des dritten unteren Molaren (M3) ist eines der wichtigsten anatomischen Elemente, das Prolagus-Arten von der Gattung Ochotona unterscheidet20,30. Es wird angenommen, dass Prolagus anagenetisch von der monospezifischen Gattung Piezodus Viret, 1929, abgeleitet wurde, einem Taxon aus dem Oligozän-Untermiozän Europas, das sich von Prolagus durch das Vorhandensein verwurzelter Backenzähne und Metaflexiden sowie das Fehlen von Protokonuliden im dritten unterscheidet Unterer Prämolar20,21,31,32. Es ist bekannt, dass Prolagus-Arten in mediterranen Inselumgebungen vorkommen, wie durch die Taxa dokumentiert, die im Gargano-Paläo-Archipel (spätes Miozän? – frühestes Pliozän) und im Sardinien-Korsika-Block (spätes Pliozän – Holozän) gefunden wurden. Auf Korsika und Sardinien wird die Gattung Prolagus durch eine anagenetische Linie repräsentiert, die drei endemische Taxa umfasst: Prolagus aff. figaro (frühes Oberpleistozän von Capo Mannu D1), Prolagus figaro López-Martínez, 1975 (spätestes Pliozän?/frühestes Pleistozän – spätes Unterpleistozän) und Prolagus sardus (Wagner, 1829) (Mittleres Pleistozän – Holozän)17,20,32, 33,34,35,36.

Unter den fossilen Überresten quartärer Wirbeltiere Sardiniens sind die von Prolagus sardus sicherlich die häufigsten37,38,39,40,41,42,43,44. Es ist wahrscheinlich, dass P. sardus eine Beute mehrerer Fleischfresser (Caniden und Marder) und Greifvögel des quartären Insel-Paläo-Ökosystems von Korsika und Sardinien war. Insbesondere scheint es möglich, dass der endemische Canid Cynotherium sardous auf die Jagd auf P. sardus spezialisiert war45,46. In mehreren archäologischen Stätten gesammelte verbrannte Überreste dokumentieren, dass P. sardus regelmäßig von den ersten Gemeinschaften moderner Menschen gejagt und gefressen wurde, die den Sardinien-Korsika-Block kolonisierten39. Dieser Lagomorph war mit Sicherheit auf Sardinien bis zur Eisenzeit (14. Jh., 2760 n. Chr. nach der Fundstelle der Su Guanu-Höhle) und auf Korsika möglicherweise bis zur Römerzeit (zwischen 2343 v. Chr. und dem 6. Jahrhundert n. Chr. nach der Fundstelle in Castellu) vorhanden. 37,38,39,47,48. Das Aussterben von P. sardus hängt jedoch wahrscheinlich mit der Einführung neuer Raubtiere und ökologischer Konkurrenten in das Inselökosystem zusammen. Die Übertragung von Krankheitserregern durch eingeschleppte Arten wie Ratten und Hasen kann als mögliche alternative oder gleichzeitige Ereignisse, die zum Aussterben dieser Art geführt haben, nicht ausgeschlossen werden37,38,39.

In dieser Studie berichten wir über die Gewinnung von Sequenzen aus dem mitochondrialen Genom von P. sardus, die aus einer radiokarbondatierten Knochenprobe stammen, die in einer archäologischen Stätte auf Sardinien gesammelt wurde. Phylogenetische Rekonstruktionen auf der Grundlage dieser DNA-Sequenzen könnten darauf hindeuten, dass die ausgestorbene Gattung Prolagus besser in eine unabhängige Schwestergruppe der Familie Ochotonidae eingeordnet werden könnte.

Der analysierte Knochen (Probe Nr. PR6) war ein unvollständiger linker Hemimandibula, der zu einem ausgewachsenen sardischen Pika gehörte, der in der Cabaddaris-Höhle (Sardinien, Italien; Abb. 1) gesammelt wurde. Die hemimandiblen Abmessungen und die dentognatischen Merkmale, wie die allgemeinen Merkmale von P3, das Fehlen von M3 und das Vorhandensein von drei Lappen in M2, ermöglichten eindeutig die Zuordnung des Knochens zu P. sardus und den Ausschluss aller ausgestorbenen und lebenden sardischen Hasentiere.

(a) Geografische Lage der Cabaddaris-Höhle (Sardinien, Italien); (b) linker Unterkiefer von Prolagus sardus (PR6-Knochen), der für die DNA-Extraktion und Radiokarbondatierung verwendet wird, aus verschiedenen Perspektiven (b1: bukkal, b2: okklusal, b3: lingual und b4: okklusale Ansicht der Backenzähne); (c) zusammengesetztes Skelett von P. sardus (Museo Sardo di Geologia e Paleontologia „D. Lovisato“, Universität Cagliari); (d) paläokünstlerische Rekonstruktion von P. sardus (Zeichnung von D. Zoboli).

Mit der Accelerator Mass Spectrometry (AMS)-Methode durchgeführte Radiokarbondatierungen ergaben einen kalibrierten Bereich von 7575 bis 7431 cal BP mit einer Wahrscheinlichkeit von 95,4 % (Ergänzungsmaterial Abb. S1). Dieses Ergebnis ordnete den analysierten Knochen dem Neolithikum (von 6000 bis 4000 v. Chr.) zu.

Es wurden die empfindlichsten und modernsten Protokolle für die aDNA-Analyse angewendet und die Effizienz der Analyse in jedem Schritt bewertet. Mehr als 32 Millionen Paired-End-Reads wurden aus der Probe PR6 generiert, aber nur ein äußerst geringer Anteil aller erhaltenen Sequenzen (0,008 %) wurde gegen das mitochondriale Referenzgenom von Ochotona curzoniae (Zugangsnummer: NC_011029.1) kartiert, was auf eine schlechte Erhaltung der aDNA hinweist dieses Exemplars.

Sequenzen, die auf die mitochondrialen Referenzgenome von O. curzoniae abgebildet wurden, berichteten über typische Muster abgebauter DNA, wie z. B. eine kurze Länge der Fragmente (durchschnittlich 40 bp) und eine zunehmende Häufigkeit von C > T-Übergängen an den extremsten Positionen jedes Lesevorgangs (Ergänzungsmaterial). Abb. S2). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Ausrichtung dieser Lesevorgänge wurde der höchste Anteil der Lesevorgänge auf den mitochondrialen Genomen O. curzoniae (NC_011029.1), O. Princeps (NC_005358.1) und Oryctolagus cuniculus (NC_001913.1) kartiert, mit 2721, 2608 bzw. 2535 eindeutige zugeordnete Lesevorgänge (nach Filterung nach Duplikaten).

Insgesamt wurden 3393 bp mit klaren alten DNA-Schadensmustern erhalten, was 19,8 % des gesamten mitochondrialen Genoms von P. sardus entspricht, wenn man es auf die moderne mitochondriale Referenzsequenz des Ochotoniden O. curzoniae (17.131 bp) bezieht. Die Verteilung der erhaltenen Sequenzen entlang dieses mitochondrialen Referenzgenoms ist im Zusatzmaterial Abb. S3 dargestellt.

Die Ausrichtung der Lesevorgänge an der O. curzoniae-Referenz-mtDNA-Sequenz ergab insgesamt 51 Konsensusregionen, von denen 12 länger als 100 bp waren (Ergänzungsmaterialtabelle S1). Insbesondere bei der Kombination der Sequenzinformationen für fünf mitochondriale Gene und für die D-Schleife waren die Sequenzdaten länger als 100 bp (Ergänzungsmaterialtabelle S2). Abbildung 2 zeigt die Rekonstruktion von P. sardus-mtDNA-Contigs, die mit den entsprechenden Regionen der O. curzoniae-mtDNA-Sequenz übereinstimmten.

Prolagus sardus mtDNA-Konsensusregionen (innerer Kreis), ausgerichtet an der vollständigen mtDNA-Sequenz von Ochotona curzoniae. Hier wurden nur Regionen gemeldet, die länger als 100 sind. Die roten Regionen entsprechen P. sardus-mtDNA-Sequenzen, die für phylogenetische Analysen verwendet wurden, stattdessen wurden blaue Regionen nicht berücksichtigt. Um die grafische Darstellung zu vereinfachen, wurden tRNA-Merkmale nicht in die Referenzsequenz einbezogen.

Phylogenetische Bäume wurden unter Verwendung der erhaltenen Sequenzinformationen von P. sardus und von 18 mitochondrialen Genomen vorhandener lagomorpher Arten (acht von den Ochotonidae und zehn von Leporidae) erstellt. Als Fremdgruppe wurde das mitochondriale Genom der Nagetierart Cricetulus griseus verwendet (Ergänzungsmaterialtabelle S3). Um Verzerrungen aufgrund zu kurzer, fragmentierter und nicht informativer mtDNA-Regionen zu vermeiden, wurden phylogenetische Analysen mit Alignments durchgeführt, die die informativen Regionen der 12S-, 16S- und D-Loop-Sequenzen oder eine kombinierte Sequenz umfassten, die nur die 12S- und 16S-Regionen umfasste. Alle betrachteten kodierenden Sequenzen wiesen keine Frameshift-Mutationen (Insertionen/Deletionen) oder Nonsense-Mutationen (Stoppcodons) auf. Einschließlich anderer Sequenzen änderten sich die Ergebnisse nicht (Daten nicht gezeigt). In allen rekonstruierten Stammbäumen war P. sardus ein Fremdgruppentaxon aller Ochotonidae, was darauf hindeutet, dass es sich möglicherweise um ein Schwestertaxon der Ochotonidengruppe handelt (Abb. 3). Maximum-Likelihood-Inferenzbäume des partiellen mitochondrialen Genoms der aus Knochen abgeleiteten Sequenzen von P. sardus bewiesen tatsächlich eindeutig, dass diese ausgestorbene Art enger mit der Ochotonidae-Gruppe als mit der Leporidae-Gruppe verwandt ist (Abb. 3). In der phylogenetischen Analyse wird die Prolagus-Ochotona-Klade mit einer maximalen Wahrscheinlichkeit von 66 % bzw. 73 % Bootstrap-Unterstützung im Alignment mit bzw. ohne D-Loop-Sequenz wiederhergestellt (Abb. 3). Knoten relativ zu den Basalclustern der beiden vorhandenen Familien von Hasentieren (Ochotonidae und Leporidae) werden erwartungsgemäß mit 100 % Bootstrap-Werten stark unterstützt, und der Basalknoten für die Gattung Lepus war einer der höchsten Werte innerhalb der Gruppe der Leporidae (66). %), sowie der Basalknoten von 63 % gruppierte die Wurzel der Ochotona-Gruppe.

Maximum-Likelihood-Bäume, erhalten mit: (a) ribosomalen mtDNA-Contig-Sequenzen (16S + 12S); (b) D-Loop- und ribosomale Contig-Sequenzen (D-Loop + 16S + 12S). Knotennummern stellen Konfidenzwerte dar. Die Verzweigungslängen sind proportional zur Anzahl der Substitutionen pro Standort.

Molekularuhranalysen der mitogenomischen Daten von P. sardus zeigten, dass sie vor etwa 30 Ma von der Ochotona-Linie abwichen (Abb. 4; ergänzendes Material Abb. S4). Unsere Divergenzschätzungen zwischen der Prolagus- und der Ochotona-Linie stimmen mit den Schätzungen aus früheren paläontologischen Studien überein49,50,51.

Divergenzdaten und 95 %-Konfidenzintervalle, die sich aus der Analyse des ~ 51 Ma-Wurzelmodells (teilweise D-Schleife + teilweise 12S + teilweise 16S-Datensatz) der in BEAST2 implementierten Bayes'schen entspannten molekularen Datierungsmethode ergeben.

Hier präsentieren wir den ersten Beweis für die DNA-Konservierung aus einem Knochen eines sardischen Pikas Prolagus sardus aus der Jungsteinzeit, der in der archäologischen Stätte der Cabaddaris-Höhle auf Sardinien geborgen wurde. Die Radiokarbondatierung des analysierten Knochens stimmte mit der erwarteten Rohschätzung des Alters der Überreste in dieser Höhle überein, basierend auf früheren archäologischen Untersuchungen der Stätte.

Die Authentizität der Sequenzdaten wurde durch saubere Negativkontrollen und DNA-Schadensmuster nachgewiesen, die keinen Zweifel an der antiken Herkunft der abgerufenen Sequenzinformationen aufkommen ließen. Der geringe Anteil der P. sardus zugeordneten aDNA, der aus dieser Probe gewonnen werden konnte, könnte jedoch die allgemeinen Schwierigkeiten bei der Gewinnung gut erhaltener DNA aus antiken Überresten des heißen Mittelmeerbeckens im Vergleich zu anderen kälteren Umgebungen wie Permafrost bestätigen12 ,52,53. Unter diesen Bedingungen könnten daher normalerweise viel mehr Kopien des mitochondrialen Genoms als die des Kerngenoms aus alten Knochen gewonnen werden. In Anbetracht der Tatsache, dass alle P. sardus-Sequenzen, die mit mtDNA-kodierenden Regionen übereinstimmen, die in den phylogenetischen Analysen verwendet wurden, keine Frameshift-Mutationen oder Stoppcodons enthielten, die die offenen Leserahmen gestört hätten, können wir vernünftigerweise ausschließen, dass sie zu im Zellkern vorhandenen mitochondrialen DNA-Sequenzen gehören könnten Genom (NUMTs)12,54,55 und daher könnte das, was wir gefunden haben, als von der wahren alten mtDNA von P. sardus abgeleitet angesehen werden.

Im Allgemeinen haben wir durch die Kartierung von Lesevorgängen für mehrere lagomorphe Arten, von denen Ochotona curzoniae, O. Princeps und Oryctolagus cuniculus diejenigen mit dem höchsten Anteil an Treffern darstellen, etwa 20 % des mitochondrialen Genoms von P. sardus wiederhergestellt. Obwohl die abgerufene Sequenz nur etwa ein Fünftel des gesamten erwarteten mitochondrialen Genoms ausmachte, ermöglichten die alten Sequenzdaten die erste molekulare phylogenetische Zuordnung dieser ausgestorbenen Art, wie sie auch für andere Arten in früheren Studien erhalten wurde, bei denen partielle mtDNA-Sequenzinformationen verwendet wurden9,12.

In der Ordnung Lagomorpha werden nur zwei existierende Familien anerkannt: Leporidae, zu der die Kaninchen, Hasen und Jackrabbits gehören; Ochotonidae, zu denen auch die Pikas gehören, sind alle in der monophyletischen Gattung Ochotona zusammengefasst28,56,57,58. Diese beiden Familien trennten sich vor etwa 51,4 Ma59,60,61. Es besteht jedoch kein allgemein akzeptierter Konsens der wissenschaftlichen Gemeinschaft hinsichtlich der intraordinalen Unterscheidung der Ordnung Lagomorpha, wenn die ausgestorbenen Gruppen berücksichtigt werden20,62,63,64,65,66. Umgekehrt wurden mehrere ausgestorbene Familien von Lagomorpha beschrieben, darunter †Paleolagidae Dice, 1929, †Mytonolagidae Burke, 1941, †Desmatolagidae Burke, 1941, †Prolagidae Gureev, 1962, †Mimolagidae Erbajeva, 1986, und †Strenulagidae Averianov und Lopatin, 200562 Darüber hinaus wurden von anderen Autoren verschiedene intraordinale Klassifikationen der Ordnung Lagomorpha vorgeschlagen23,67. Die Familie Prolagidae umfasst pikaartige Hasenartige, die vom Oligozän-untersten Miozän bis zum Holozän in den Fossilienbeständen des perimediterranen Gebiets vorkommen.

Phylogenetische Analysen, die wir mit den erhaltenen P. sardus-Sequenzen durchgeführt haben, wurden mit einem Datensatz entsprechender 12S-, 16S- und D-Loop-Sequenzen von mtDNA von modernen Lagomorpha-Arten aus verschiedenen Kontinenten durchgeführt, wobei das mitochondriale Genom einer Nagetierart als Außengruppe verwendet wurde. Wie erwartet stützte die phylogenetische Analyse die Knoten der beiden vorhandenen Familien mit starken Werten sowohl für Leporidae als auch für Ochotonidae. Darüber hinaus stimmten innerhalb der Ochotonidae-Familie feine phylogenetische Beziehungen mit früheren Studien dieser Gruppe von Säugetieren überein, die auf Cytochrom b- und ND4-mtDNA-Genen basierten, was darauf hindeutet, dass die in dieser Studie verwendete partielle mtDNA-Sequenz keine phylogenetischen Mikrostrukturen und Beziehungen innerhalb der Ordnung übersah .

Die mit und ohne D-Loop-Region erhaltenen phylogenetischen Bäume bestätigten übereinstimmend die Position von P. sardus in einer Schwestergruppe der Familie Ochotonidae. Die Prolagus-Ochotona-Klade wurde in beiden Analysen mit guter statistischer Unterstützung gewonnen (66 % bzw. 73 % des Bootstrap in den beiden phylogenetischen Rekonstruktionen, dh mit bzw. ohne D-Loop-Sequenz). Im Allgemeinen stiegen die Knotenwerte mit der Hinzufügung der D-Loop-Sequenz im Alignment für alle Divergenzknoten, während dieser Wert für den Knoten der P. sardus-Linie abnahm. Dies könnte hauptsächlich auf die unterschiedlichen Mutationsverhältnisse in dieser hypervariablen Region zurückzuführen sein71,72.

Die in BEAST implementierte bayesianische molekulare Datierung zeigte, dass P. sardus von Ochotona spp. abweicht. etwa 30 Ma (CI: 15–59 Ma). Daher stützen unsere molekularphylogenetischen Analysen ein unabhängiges Evolutionsszenario für die oligozän-holozäne Piezodus-Prolagus-Linie, wie zuvor durch paläontologische Daten nahegelegt. Darüber hinaus stützen die verfügbaren Daten die Hypothese, die Gattung Prolagus zur eigenständigen Familie Prolagidae zu zählen. Unsere Ergebnisse können daher darauf hindeuten, dass ein neues Taxon, einschließlich Prolagus, die gefundene molekulare Diversität und damit auch die in paläontologischen Studien beschriebene morphologische Diversität besser erklären könnte, im Einklang mit den Vorschlägen einiger Autoren, die nur paläontologische Informationen verwendeten23,24,25,26 ,27,28.

Diese Studie liefert die erste molekulare systematische Charakterisierung von P. sardus und ebnet den Weg für seine korrekte phylogenetische Zuordnung. Weitere Studien sind erforderlich, um eine vollständige mtDNA-Sequenz dieser ausgestorbenen Art zu erhalten, die die abgeleitete molekulare Datierung bestätigen kann. Es sollten auch weitere P. sardus-Proben untersucht werden, um aDNA von mehr Individuen zu gewinnen und die intraspezifische Diversität dieser Art zu verstehen. Es könnte auch interessant sein, den Entwicklungsverlauf dieser Art im Laufe der Zeit zu bewerten, indem man die aDNA anderer Exemplare analysiert, die über einen weiten Zeitraum datiert und sowohl auf Sardinien als auch auf Korsika gefunden wurden.

Ein Unterkiefer von Prolagus sardus (PR6), der an der archäologischen Stätte der Cabaddaris-Höhle (Lat. 40°08′46′′, Länge. 3°00′45′′; Supramonte di Orgosolo, Nuoro) auf Sardinien (Italien) ausgegraben wurde in dieser Studie verwendet (Abb. 1). Die Probe wurde in einer archäologischen Stätte aus der vornuraghischen Zeit Sardiniens geborgen. Da jedoch keine eindeutigen stratigraphischen Daten verfügbar waren, wurde die Probe zur Radiokarbondatierung geschickt. Der Knochen umfasste den kompletten Corpus mandibulae und einen Teil des Ramus mandibulae. Der Processus condylaris und der proximale Teil des Processus coronoideus blieben nicht erhalten. Das Gebiss war vollständig und die unteren Schneidezähne und die Backenzähne (P3-M2) waren gut erhalten. In der Cabaddaris-Höhle wurden im Zusammenhang mit diesem Unterkiefer und den menschlichen Artefakten keine Überreste anderer Hasentiere gefunden. Die Probe wurde von der Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Sassari e Nuoro zur Verfügung gestellt. Die Soprintendenza vertritt die territorialen Zweige der Regierung, die für die Verwaltung und Betrauung des kulturellen Erbes in Italien verantwortlich sind.

Biomolekulare (z. B. aDNA, Paläoproteomik) und physikalisch-chemische (z. B. Isotope, Radiokarbondatierung) Analysen liefern grundlegende Informationen und Daten, beinhalten jedoch häufig destruktive oder mikrodestruktive Ansätze. Um wertvolle antike Überreste zu bewahren, ist es wichtig, nach Möglichkeit geeignete Methoden der digitalen Erfassung anzuwenden, um zukünftige Analysen zu ermöglichen oder die Möglichkeit zu lassen, für Museumszwecke auf eine Reproduktion der Überreste zuzugreifen. Daher wurde Mikrophotogrammetrie verwendet, um vor der DNA-Extraktion und der Radiokarbondatierung ein grafisches 3D-Modell des Unterkiefers zu erhalten (Abb. 1). Wir haben insgesamt 85 hochauflösende Fotos mit der Kamera Olympus OM-D E-M10 MarkII und Olympus M. Zuiko Digital ED 12–50 mm Objektiven bei 0,36x (Makromodus) gemacht. Die Bilder wurden anschließend mit der Software Agisoft Photoscan PRO (Agisoft, St. Petersburg, Russland) erfasst und verarbeitet, indem dichte Wolken aus fünf verschiedenen Blöcken zusammengeführt und das erhaltene Modell manuell auf insgesamt 3000 Punkte verfeinert wurden. Das hier erhaltene 3D-Modell ist im MorphoSource-Repository verfügbar (https://www.morphosource.org/concern/media/000494910).

Um eine Radiokarbondatierung des Überrestes von Prolagus sardus zu erstellen, wogen wir den Kiefer mit einer Präzisionslaborwaage (0,9 g). Die Probe wurde zur Radiokarbondatierung an das Labor des Center of Dating and Diagnostic, Department of Mathematics and Physics (CEDAD) der Universität Salento (Italien) geschickt, das mit der CEDAD Accelerator Mass Spectrometry (AMS) nach den zuvor beschriebenen Methoden erhalten wurde73 ,74. Zur Qualitätskontrolle der Ergebnisse wurden vom National Institute of Standard and Technology (NIST) bereitgestellte Referenzproben bekannter Oxalsäurekonzentration verwendet. Anschließend wurde die Radiokarbondatierung anhand des Kalenderalters mithilfe von OxCal Ver kalibriert. 3.10-Software basierend auf INTCAL20-Atmosphärendaten75.

Die PR6-Probe, dargestellt durch einen fast vollständigen linken Kiefer (Abb. 1), wurde im Ancient DNA Laboratory der Universität Bologna (Abteilung für Kulturerbe, Ravenna, Italien) verarbeitet. Für aDNA-Analysen wurden strenge Kriterien befolgt, um die Authentifizierung der Daten sicherzustellen und Kontaminationen zu vermeiden76,77,78. Tatsächlich wurden bei der Handhabung der Proben Einweg-Overalls, doppelte Handschuhe, Stiefel, Gesichtsmasken und Kunststoff-Gesichtsschutz getragen. Die Arbeitsplatte und die Instrumente wurden nach jedem Experiment regelmäßig mit DNA Exitus Plus-Lösung (AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland) oder ~ 5 % handelsüblichem NaClO gereinigt und 30 Minuten lang ultravioletter Strahlung bei 254 nm ausgesetzt. Darüber hinaus wurden DNA-freie Reagenzien verwendet und für jede Probencharge wurden Negativkontrollen durchgeführt. Darüber hinaus wurden PCR-Reaktionen und Post-PCR-Verfahren in einem physisch isolierten Bereich durchgeführt.

Von den Zähnen, dargestellt durch einen Schneidezahn und die Backenzähne, die alle noch in den Alveolen eingeschlossen waren, wurden Proben entnommen und zusammengeführt. Aufgrund der geringen Größe der Zähne war es nicht möglich, nur den Zementanteil zu beproben. Sie wurden dekontaminiert, indem 1,5–2,0 % Natriumhypochlorit auf die Zahnoberfläche gesprüht wurde. Anschließend wurde das Bleichmittel mit einem sauberen, mit DNA-freiem Wasser gespülten Papiertuch entfernt. Anschließend wurden sie mindestens 20 Minuten lang unter ultraviolettem (UV) Licht (Wellenlänge 254 nm) in einem Abstand von ~ 25 cm von der Glühbirne luftgetrocknet. Dann wurden sie in einem Mörser zerstoßen und es wurden etwa 100 mg Pulver gewonnen. Die DNA-Extraktion wurde unter Verwendung einer modifizierten Version eines auf Kieselsäure basierenden Säulenprotokolls durchgeführt, indem ein Vorverdauungsschritt hinzugefügt wurde79,80,81. In den Prozess wurde eine Extraktions-Negativkontrolle einbezogen. Kurz gesagt bestand der Verdauungspuffer aus 0,45 M EDTA, 0,25 mg/ml Proteinase K, 0,05 % Tween, der Bindungspuffer war der PB-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland) und die Silica-Säulen stammten von High Pure Viral Nucleic Acid Large Volumenkit (Roche, Basel, Schweiz). Es wurden zwei Waschschritte mit PE-Puffer (Qiagen) durchgeführt und schließlich wurde die DNA in 50 µL EB-Puffer (Qiagen) eluiert und mit einem Qubit-Instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und einem High Sensitivity Assay dsDNA-Kit (Thermo) quantifiziert Fisher Scientific).

Wir versuchten zunächst ein Multiplex-mtDNA-Sequenzerfassungsprotokoll82 mit selbst hergestellten Ködern, die aus der Langstrecken-PCR von Ochotona Princeps-DNA gewonnen wurden, aber die Anreicherung alter mtDNA war erfolglos (Daten nicht gezeigt). Dann fuhren wir mit einem Schrotflinten-Ansatz fort. Insgesamt 20 µL des eluierten Materials wurden zusammen mit einer Bibliothek als Negativkontrolle in Einzelstrangbibliotheken83 umgewandelt. Die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für die Indexierung wurde durch Echtzeitamplifikation auf dem ABI 7500 PCR-System (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die Indexierungsamplifikation wurde durchgeführt, indem 48 µL jeder Bibliothek in zwei 50 µL-Reaktionen für 18 Zyklen aufgeteilt wurden, wobei ein dualer Indexierungsansatz und AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Thermo Fisher Scientific) verwendet wurden. Die amplifizierten Bibliotheken wurden unter Verwendung von 0,9X AMPure SPRI-Beads (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, USA) gereinigt und auf dem Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) unter Verwendung des DNA1000-Kits (Agilent Technologies) quantifiziert. Die indizierten Bibliotheken dieser und anderer alter Proben wurden dann in äquimolaren Mengen gepoolt und auf einer Spur einer Illumina HiSeq Millionen Paired-End-Lesevorgänge.

Rohdaten wurden zunächst mit FastQC84 untersucht, um die Leistung des Sequenzierungsprozesses zu bewerten. Sequenzen wurden mit Paleomix85 verarbeitet, indem Paired-End-Reads mit den vollständigen Versionen von sieben mitochondrialen Genomen verschiedener Arten abgeglichen wurden: Sciurus vulgaris (Zugangsnummer: NC_002369.1), Lepus capensis (GU937113), Mus musculus (NC_005089.1), Ochotona curzoniae (NC_011029.1), O. Princeps (NC_005358.1), Oryctolagus cuniculus (AJ001588.1) und Homo sapiens (NC_007092.1). Kurz gesagt: Adapter wurden mithilfe von AdapterRemoval mit milden Parametern getrimmt (maximal zulässige Anzahl von Abweichungen beim Trimmen von Barcodes ≤ 3, Lesevorgänge werden verworfen, wenn die Länge < 20 ist). Um die Zuordnung alter Lesevorgänge an den Enden der zirkulären Referenzgenome zu verbessern, haben wir mit dem in EAGER86 implementierten CircularGenerator-Tool verlängerte Versionen (Verlängerungswert k = 500) der Mitogenome generiert. Die reduzierten Lesevorgänge wurden zunächst mithilfe des BWA-Backtrack-Algorithmus an den verlängerten Referenzen ausgerichtet, wobei die Mindestqualität der auszurichtenden Lesevorgänge ≥ 20 war und die Verwendung der Seed-Region deaktiviert war87. Vorläufige BAM-Dateien wurden dann mithilfe des CircularMapper-Tools von EAGER an die Standardversion der Referenzmitogenome angepasst. Duplikate wurden mit PCRDuplicates auf Paleomix85 entfernt. Die Authentizität der Daten wurde schließlich geschätzt, indem mit mapDamage288 die Häufigkeit von C > T entlang der 5'- und 3'-Enden der Lesevorgänge berechnet und die Anzahl der Lesevorgänge beobachtet wurde, die mit dem menschlichen Referenzgenom übereinstimmten. Sequenzen mit einer Mindesttiefe von 3X wurden anschließend manuell mit Integrative Genomics Viewer (IGV)89 überprüft und für weitere Analysen verwendet. Die Rekonstruktion der mtDNA-Contigs von P. sardus wurde mit GenomeVX90 unter Verwendung der mtDNA-Referenzsequenz von O. curzoniae (Zugangsnummer: NC_011029.1; 17.131 bp) durchgeführt.

Die in dieser Studie erhaltenen Prolagus sardus-Sequenzen wurden mit 18 zuvor veröffentlichten 12S-, 16S- und D-Loop-Regionen der mtDNA von modernen Lagomorpha-Arten verschiedener Kontinente und einer Rodentia-Art (Cricetulus griseus) als Außengruppe abgeglichen. Die Liste der Arten und die entsprechenden Informationen sind in der Ergänzungsmaterialtabelle S1 aufgeführt. Die Ausrichtung wurde mit MEGA X91 und dem Tool ClustalW durchgeführt. Phylogenetische Analysen wurden an phylogenetisch informativen Regionen des mtDNA-Genoms (12S, 16S und D-Loop) durchgeführt, die zuvor für die beiden Lagomorph-Familien Leporidae und Ochotonidae60,71,92 etabliert wurden. Zwei phylogenetische Analysen wurden unter Verwendung der folgenden Sequenzinformationen durchgeführt: (i) ein erhaltenes Contig, das drei partielle ribosomale Sequenzen verbindet (zwei Contigs der 16S-Genregionen mit 259 bp bzw. 154 bp; und 1 Contig der 12S-Genregion mit 118 bp). ) für insgesamt 531 bp der mtDNA-Sequenz von P. sardus: (ii) Zu diesem Contig wurde ein Teil der D-Loop-Sequenz von 200 bp hinzugefügt, um einen weiteren kombinierten Contig von 731 bp der mitochondrialen Genomsequenz von P. sardus zu erhalten . Mit RAxML-NG93 wurden Maximum-Likelihood-Bäume erhalten, die für jeden Datensatz einen beginnenden Neighbour-Joining-Baum (NJ) basierend auf der Modellsubstitutionsmatrix von Jukes und Cantor (JC)94 mit 1000 Bootstraps bereitstellten, wie vom Tool „Modelle“ vorgeschlagen. , implementiert in MEGA X91. Das am besten geeignete Modell (JC) wurde ausgewählt, da es die beste Wahrscheinlichkeit mit und ohne Fremdgruppe zeigte (LnL -3021,9; LnL -20.647,8).

Die bayesianische Schätzung der Divergenzzeit zwischen P. sardus und anderen Lagomorpha-Taxa wurde mit BEAST 2.595 unter Verwendung von Alignments von Teilsequenzen von D-Loop-, 16S- und 12S-mtDNA-Regionen erhalten, die bereits für die phylogenetischen Analysen verwendet wurden. Es wurden Bayes'sche Schätzanalysen durchgeführt, die Arten der beiden Familien der Lagomorpha-Ordnung (Leporidae und Ochotonidae) und eine Außengruppe der Ordnung Rodentia (Cricetulus griseus, Zugangsnummer NC_007936.1) umfassten. BEAST 2.5 wurde unter der Annahme einer Kombination von Parametern durchgeführt, darunter ein JC69-, Gamma4-Substitutionsmodell, eine entspannte, nicht korrelierte logarithmische molekulare Uhr und ein Yule-Artbildungsprozess91,96. Die folgenden drei Kalibrierungspunkte wurden unter Berücksichtigung einer Log-Normalverteilung definiert: (i) die Divergenz (jüngster gemeinsamer Vorfahre, MRCA) zwischen den Familien Ochotonidae und Leporidae (51,4 Ma, CI 49,6–53,1)59,60,61; (ii) der Divergenzknoten der Ochotona-Gruppe (12,2 Ma, CI 10,9–19,4)60,61; (iii) der Knoten zwischen Romerolagus diazi und der Gattung Lepus (17,6 Ma, CI 13,4–23,7)92,97. Die Analysen basierten auf zwei unabhängigen Markov Chain Monte Carlo (MCMC)-Ketten, die jeweils aus 10.000.000 Ketten bestanden. Die Daten wurden alle 1.000 Punkte erfasst und der Burn-In wurde auf 10 % eingestellt. Die Werte für Kettenkonvergenz und effektive Stichprobengröße (ESS) über 200 wurden mit Tracer v. 1.5 ausgewertet (verfügbar: http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer). TreeAnnotator v. 2.6.7 (Verfügbar: https://beast.community/treeannotator, Zugriff 2022 Gen 1) und Figtree v. 1.4.4 (Verfügbar: http://http://tree.bio.ed.ac. uk/software/figtree/, abgerufen am 1. Dezember 2021) wurden verwendet, um die endgültigen Bäume zu kommentieren und zu veranschaulichen.

Eine unabhängige Uhrenanalyse wurde unter Anwendung der RelTime-Methode durchgeführt, die in der Software MEGA X91,98,99 verfügbar ist. Die Zweiglängen wurden mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode (ML) berechnet und das Jukes-Cantor-Substitutionsmodell angewendet100. Eine Einstellung für den Kalibrierungstyp „Log-Normalverteilung“ mit zwei Kalibrierungsbeschränkungen (Leporidae-Ochotona-Divergenzknoten und Basisknoten der Gattung Ochotona) wurde mit dem gleichen Timing wie für BEAST 2.5-Analysen angewendet. Die Methode von Tao et al.99 wurde verwendet, um minimale und maximale Zeitgrenzen für Knoten festzulegen, für die Kalibrierungsdichten bereitgestellt wurden, und Konfidenzintervalle wurden mit derselben Methode berechnet100. Balken um jeden Knoten stellen 95 %-Konfidenzintervalle dar. Eine diskrete Gammaverteilung wurde verwendet, um Unterschiede in der Evolutionsrate zwischen Taxa zu modellieren. Die geologische Zeitskala folgte Gradstein et al.101

Der während der aktuellen Studie generierte und analysierte Sequenzierungsdatensatz ist im Repository des EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) (http://www.ebi.ac.uk/ena) unter dem Studienzugang PRJEB57248 verfügbar. Das 3D-Modell der Probe ist im MorphoSource-Repository verfügbar (https://www.morphosource.org/concern/media/000494910).

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Prof. Chiara Angelone (Universität Roma Tre) für die Vorschläge und Kommentare zum Manuskript und Dr. Caterinella Tuveri (Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Sassari e Nuoro) für die Bereitstellung der Knochenprobe von Prolagus sardus. Diese Arbeit wurde im Rahmen der LaGomiCs-Initiative und der COST Action RGB-Net: European Network on Rabbit Genome Biology (TD1101) durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch RFO-Mittel der Universität Bologna unterstützt.

Abteilung für Agrar- und Lebensmittelwissenschaften, Abteilung für Tierwissenschaften, Universität Bologna, Viale Giuseppe Fanin 46, 40127, Bologna, Italien

Valerio Joe Utzeri, Anisa Ribani, Samuele Bovo und Luca Fontanesi

Abteilung für Kulturerbe, Universität Bologna, Via degli Ariani 1, 48121, Ravenna, Italien

Elisabetta Cilli, Francesco Fontani, Adriana Latorre, Giorgio Gruppioni und Donata Luiselli

Abteilung für chemische und geologische Wissenschaften, Universität Cagliari, Cittadella Universitaria SS 554, 09042, Monserrato, Italien

Daniel Zoboli und Gian Luigi Pillola

Labor für Mikrobielle Ökologie, Istituto Zooprophylattico Sperimentale delle Venezie, Viale dell'Università 10, 35120, Legnaro, Italien

Massimiliano Orsini

AN Severtsov Institut für Ökologie und Evolution der Russischen Akademie der Wissenschaften, Moskau, Russland

Andrey A. Lissovsky

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VJU und LF konzipierten die Studie. VJU, EC, LF und DL haben die Experimente entworfen. VJU, EC, AR, AL, FF führten die Experimente durch. VJU, FF und EC analysierten die Daten. VJU, FF und DZ erstellten Abbildungen und/oder Tabellen. DZ, MO, GLP, SB, GG und DL steuerten Reagenzien/Materialien/Analysewerkzeuge bei. LF, VJU, EC und DL haben Entwürfe des Papiers verfasst oder überprüft. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Entwurf zu.

Korrespondenz mit Valerio Joe Utzeri, Elisabetta Cilli oder Luca Fontanesi.

LF ist Mitglied der Redaktion von Scientific Reports. Die Autoren geben keine weiteren Interessenkonflikte an.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Utzeri, VJ, Cilli, E, Fontani, F et al. Alte DNA wirft erneut die Frage nach der phylogenetischen Position des sardischen Seehechts Prolagus sardus (Wagner, 1829), einem ausgestorbenen Hasenmorphen, auf. Sci Rep 13, 13635 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40746-w

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Eingegangen: 18. März 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40746-w

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